تولیدات گیاهی

شماره جاری

بر اساس شماره‌های نشریه

بر اساس نویسندگان

بر اساس موضوعات

نمایه نویسندگان

نمایه کلیدواژه ها

درباره نشریه

اهداف و چشم انداز

بانک ها و نمایه نامه ها

پرسش‌های متداول

اخبار و اعلانات

راهنمای تهیه مقاله

فرم های نشریه

مقایسه سه روش مختلف استخراج RNA ژنومی از پوست و گوشت میوه پرتقال تامسون ناول (Citrus sinensis L.)

نوع مقاله : علمی پژوهشی - اصلاح نباتات

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری علوم و مهندسی باغبانی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.

2 دانشیار گروه مهندسی علوم باغبانی و فضای سبز، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان ، ایران.

3 دانشیار گروه پژوهشی زیست فناوری مولکولی گیاهی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران.

4 استادیار بخش تحقیقات علوم زراعی و باغی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان مازندران، ساری، ایران.

5 دانشیار گروه مهندسی علوم باغبانی و فضای سبز، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.

6 استادیار گروه اصلاح نباتات و بیوتکنولوژی، دانشکده تولید گیاهی، دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی گرگان، گرگان، ایران.

چکیده

پژوهش حاضر به منظور مقایسه روش­های مختلف استخراج  RNAکل با کیفیت بالا در پرتقال تامسون ناول می­ باشد. مرکبات جز یکی از میوه­ های استراتژیک در ایران محسوب می­گردد و یافتن روش مناسب و کم­هزینه برای کارهای اجرایی و مولکولی حائز اهمیت است. مواد گیاهی مورد استفاده برای استخراج RNA کل از دو قسمت مختلف پوست (شامل فلاودو و آلبدو) و گوشت پرتقال تامسون ناول از ایستگاه تحقیقات باغبانی قائم­شهر، مازندران در سال 1398 جمع ­آوری شدند. میوه­ ها بعد از نمونه ­گیری، در نیتروژن مایع به حالت فریز شده قرار گرفتند و تا زمان استفاده در منفی 80 درجه سانتی­گراد نگهداری شدند. به منظور تجزیه و تحلیل مولکولی، نمونه­ها به آزمایشگاه گروه باغبانی گرگان منتقل شدند. و برای مطالعه از سه روش شامل: تریازول، دنازیست غیر­ستونی و RNX-PlusTM  استخراج RNA کل ارزیابی گردید.  به­ منظور نشان دادن کیفیت و کمیت RNA، بر روی ژل آگارز 1% و با استفاده از اسپکتوفتومتر نانو­درآپ در طول موج 230، 260 و 280 تعیین گردید. نتایج با استفاده از طرح کاملا تصادفی در سه تکرار و آزمون دانکن در سطح معنی­دار 5 درصد و با استفاده از نرم افزار SAS 9.0 مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. نتایج وجود باندهای ریبوزومی S28 و S18 مجزا و واضح روی ژل الکتروفورز نمایش می­دهد و یکپارچگی RNA با باندهای ریبوزومی شارپ بدست آمد. همچنین با استفاده از این روش­ها نسبت جذب 280/260، بین 94/1- 80/1 بیانگر این است که، نمونه­ها بدون آلودگی پروتئین در RNA استخراج شده بودند. و در نسبت جذب 230/260، بین 14/2- 0/2 نمونه­ها بدون آلودگی پلی­ساکارید و فنل نشان ­داده شد. در مقایسه با سایر روش­ها، در روش تریازول اختلاف معنی­داری مشاهده شد. این روش به طور موفقیت آمیزی باعث جداسازی RNA از دو بخش میوه پرتقال شد. به­طورکلی نمونه­های جذب 9/1 تا 2 بیشترین خلوص RNA استخراجی دارند و متوسط غلظت  RNA در روش تریازول به ترتیب در پوست پرتقال 90/379 (نانو گرم بر میکرو لیتر) و گوشت پرتقال 15/352 (نانو گرم بر میکرو لیتر) داشتند. و کمترین غلظت در روش دنازسیت غیر­ستونی به میزان 10/263 (نانو گرم بر میکرو لیتر) در گوشت میوه محاسبه گردید. روش تریازول یکی از بهترین­ها برای استخراج RNA کل باکیفیت می­باشد. در ارتباط با این روش بیشترین غلظت و خلوص RNA در نمونه ­های مختلف (پوست و گوشت) پرتقال نشان داد. به طور کلی در نمونه­ های پوست (فلاودو و آلبدو) غلظت RNA بیشتری بدست آمد.
 

کلیدواژه‌ها

موضوعات

عنوان مقاله [English]

Comparison of three different genomic RNA extraction methods from peel and pulp of Thomson navel orange fruit (Citrus sinensis L.)

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Ahmadi 1
  • Mohamad Mehdi Sharifani 2
  • Amir Mosavi 3
  • Negin Akhlaghi Amiri 4
  • Mostafa Khoshhal sarmast 5
  • Khalil Zaynali Nezhad 6

1 PhD Student, Department of Horticultural Science and Engineering, Faculty of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Golestan, Iran.

2 Associate Professor, Department of Horticultural Science and Landscape Engineering, Faculty of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Golestan, Iran

3 Associate Professor, Department of Plant Molecular Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology (NIGEB), Tehran, Iran.

4 Assistant Professor, Department of Horticulture Crops Research, Mazandaran Agricultural and Natural Resources Research and Education Center, AREEO, Sari, Iran.

5 Associate Professor, Department of Horticultural Science and Landscape Engineering, Faculty of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Golestan, Iran.

6 Assistant Professor, Department of Plant Breeding & Biotechnology, Faculty of Plant Production, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Gorgan, Golestan, Iran.

چکیده [English]

Introduction
Efficient genomic RNA extraction is a basic requirement of molecular biology and the primary step in the study of gene expression. Woody plants are problematic due to the presence of polyphenolics, polysaccharides and other compounds that bind or co-precipitate with the RNA. The present study is to compare different methods of extracting high-quality total RNA in Thomson navel orange. Citrus is one of the most strategic fruits of Iran, finding an efficient and low-cost method is important for executive and molecular works.
 
Materials and Methods
Plant materials used to extract total RNA were collected from two different parts of Thomson navel orange peel (consisting of both flavedo and albedo) and pulp from Ghaemshahr Horticultural Research Station, Mazandaran in 2020. Fruits were frozen in liquid nitrogen after sampling and were stored at -80°C until used. These samples were transferred to the laboratory department of horticultural science and engineering, Gorgan where the samples were applied to analyze the molecular expriment. For this study three methods including of: Trizol, Non-column Denazist and RNX-PlusTM were evaluated for total RNA extraction. In order to show the quality and quantity of RNA, were assessed on 1% agarose gel and using a nano­drop spectrophotometer with 230, 260 and 280 wavelength. Results were analyzed using a completely randomized design with three replicates, Duncan test with a significance level of 0.05 using SAS 9.0 software.
 
Results and Discussion
The result showed a distinct 28S and 18S rRNA bands visible on an agarose gel. The RNA integrity was assessed by the sharpness of ribosomal RNA bands. Also by using this protocols, the absorbance ratio at 260/280 was ranged between 1.80 – 1.93 which indicated there were no protein in the extracted RNA. A ratio A260/ A280 ratio from 2.0 to 2.14 indicated a lack of polysaccharides and phenol contamination. Trizol method, which was significantly different than compared to other methods. This protocol was successfully applied to isolate total RNA from the organ of two section fruit. Generally, the samples with a ratio in the range of ~ 1.9 to 2 revealed high purity of the extracted RNA using Trizol and the average concentration of RNA ranged from 379.90 (ng/µl) of orange peel and 352.15 (ng/µl) of orange pulp, respectively.  And concentration was observed in Non-column Denazist method which treated with the lowest concentration (263.10 ng/µl) of orange pulp.
 
Conclusion
The Trizol method was the best choice for extraction of high-quality total RNA. In this respect method represented the highest RNA yield and purity from various samples (peel and pulp) of citrus. However, generally peel samples (flavedo and albedo) produced high concentration total RNA.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Citrus sinensis
  • extraction
  • peel
  • pulp
  • ribonucleic acid
مراجع
Ahsani, M.R., Mohammadabdi, M.R., Asadi Fozi, M., Esmaelzadeh, A., Kezri, A., & Esmaili, H. 2019. Leptin gene expression in subcutaneous adipose tissue of Holstein dairy cattle using Real time PCR. Agricultural Biotechnolog Journal, 11(1), 135-150. [In Persian]
Asif, M.H., Dhawan, P., & Math, P. 2000. A simple procedure for isolation of high quality RNA from ripening banana fruit. Plant Mol Bio.Rep, 18, 109-115.
Bahador, S., Rabiei, B., & Hassani Kumleh, S.H. 2014. Comparison of different methods for isolating of total RNA from leaf of Thyme species rich in secondary metabolites. Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 22(1), 11-24. [In Persian]
Bahri, B., Banihashemian, S.M., Kulivand, D., & Radmand, O. 2013. Application of a simple nucleic acid extraction method for detection of Citrus Tristeza virus. 8th National Biotechnplogy Congress of I.R. Iran. [In Persian]
Bernad, L., & Duran-Vila, N. 2005. A novel RT-PCR approach for detection and characterization of citrus viroids. Molecular and Cellular Probes, 20(2), 105-113.
Cheng, Y., Gue, W., Yi, H., Pang, X., & Deng, X. 2003. An efficient protocol for genomic DNA extraction from Citrus species. Plant Molecular Biology, 21, 177a-177g.
Cong, L., De-xiong, L., Xian-bia., H., Fu-qiong, Zh., Zong-zhou, X., Hong-yan, Zh., & Ji-hong, L. 2022. Manual thinning increases fruit size and sugar content of Citrus reticulate Blanco and affects hormone synthesis and sugar transporter activity. Journal of Integrative Agriculture, 21(3), 725-735.
Fattahi Moghadam, J., Seyed Ghasemi, S.E., & Najafi, K. 2017. Evaluation of fruit physico- chemical characteristics of new mandarins- Noushin (Citrus reticulata cv. Noushin) and Shahin (Citrus reticulata cv. Shahin) during different harvesting time. Plant Production, 40(4), 77-90. [In Persian]
Gambiono, G., Perrone, I., & Grbaudo, I. 2008. A Rapid and effective method for RNA extraction from different tissues of grapevine and other woody plants. Phytochemical Analysis, 19, 520-525.
Ghaderi, A., & Jahanbakhsh Godehkahriz, S. 2020. Study of total protein content, soluble sugar, proline content and P5CS gene expression in leaves of three wheat cultivars under drought stress. Agricultural Biotechnology Journal, 12(4), 125-144. [In Persian]
Ghangal, R., Raghuvanshi, S., & Sharma, P.C. 2009. Isolation of good quality RNA from a medicinal plant seabuckthorn rich in secondary metabolites. Plant Physiology and Biochemistry, 47(11-12), 113-115.
Ghawana, S., Paul, A., Kumar, H., Kumar, A., Singh, A., Bhardwaj, P., Rani, A., Singh, R., Raizada, J., Singh, K., & Kumar, S. 2011. An RNA isolation system for plant tissues rich in secondary metabolites. BMC Research Notes, 4, 85.
Heidary, M., & Pahlevan Kakhki, M.  2014. TRIZOL-based RNA extraction: a reliable method for gene expression studies. Journal of sciences, Islamic Republic of IRAN, 25(1), 13-17.
Iqbal, A., Yang,Y., Wu, Y., Li, J., Hamayun, M., Hussain, A., & Shah, F. 2020. An easy and robust method for the isolation of high quality RNA from coconut tissues. Journal of Biotechnology, 48, 78-85.
Javdan-Asl, M., Rajabi Memari, H., Nabati Ahmadi, D., & Rahnama, A. 2016.  Comparision of different genomic RNA extraction methods from the medicinal plant yarrow (Achillea millefolium L.). Plant Productions, 39(2), 105-114. [In Persian]
Jones-Rhoades, M.W., Bartel, D.P., & Bartel, B. 2006. MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annual Review of Plant Biology, 57, 19-53.
Liu, Q., Xu, J., Liu, Y., Zhao, X., Deng, X., Guo, l., & Gu, J. 2007. A novel bud mutation that confers abnormal patterns of lycopene accumulation in sweet orange fruit (Citrus sinensis L. Osbeck). Journal of Experimental Botany, 58(15/16), 4161-4171.
Liu, Y., Liu, Q., & Tao, N. 2006. Efficient isolation of RNA from fruit peel and pulp of ripening navel orange (Citrus sinensis L. Osbeck). Journal Huazhong Agricultural University, 25(3), 300-304.
Lyu, sh., Chen, G., Pan, D., Chen, J., & She, W. 2021. Molecular analysis of 14-3-3 genes in Citrus sinensis and their responses to different stresses. International Journal of Molecular Sciences, 22(2), 568.
Rohlah Amin, S., Zahedi, B., Sai, A., & Nazarian Firoz abadi, F. 2015. Comparison of different method for RNA extraction of pomegranate peel. New Cellular Biotechnology– Molecular Journal, 5(19), 39-46. [In Persian]
MacRae, E. 2007. Extraction of plant RNA. Methods in Molecular Biology, 353, 15-24.
Majidi, M., & Bahmani, Y. 2017. Isolation of high-quality RNA from a wild range of woody plants. Journal of Plant Molecular Breeding, 5(2), 50-59. [In Persian]
Mansouri, M., Hosseini pour, A., Sharifi-sirchi, S., & Massumi, H. 2010. Changes in chitinase and ß-1,3-glucanase transcript levels in sweet orange (Citrus sinensis) in response to treatment with N Xanthomonas citri subsp. Citri. Agricultural Biotechnolog Journal, 1(2), 39- 52. [In Persian]
Montazeri, Sh., & Sadat, Sh. 2017. Comparision of different RNA extraction methods from the leaf apple (Malus domestica). New Cellular Biotechnology– Molecular Journal, 7(27), 55-62. [In Persian]
Naderi, S., Fakheri, B.A., Esmaeilzadeh Bahabadi, S., & Kamaladini, H. 2015. Increasing of phenyl alanine ammonia lyase (PAL) gene expression and phenylpropanoid compound of basil (Ocimum  basilicum) by chitosan. Modern Genetics Journal, 9(3), 259-266. [In Persian]
Nath, O., Fletcher, S., Haward, A., Shaw, L., Agarwal, R., Furtado, A., Henry, R., & Mitter, N. 2022. A comprehensive high-quality DNA and RNA extraction protocol for a range of cultivars and tissue types of the woody crop avocado. Plants, 11, 242.
Nehela, Y., & Killiny, N. 2020. Melatonin is involved in citrus response to the pathogen Huanglonggbing via Modulation of phytohormonal biosynthesis. Plant Physiology, 184(4), 2216- 2239.
Shu, C., Sun, S., Chen, J., Chen, J., & Zhou, E. 2014. Comparison of different methods for total RNA extraction from sclerotia of Rhizoctonia solani. Electronic Journal of Biotechnology, 17(1), 50-54.
Song, Ch., Cao, X., Nicholas, K., Wang, Ch., Li, X., & Fang, J. 2010. Extraction of low molecular weight RNA from Citrus trifolita tissues for microRNA northern blotting and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). African Journal of Biotechnology, 9(51), 8726-8730.
Tao, N., Cheng, Y., Xu, J., Xu, Q., & Deng, X. 2004. An effective protocol for the isolation of RNA from the pulp of ripening citrus fruit. Plant Molecular Biology, 22, 305a-305f.
Tele, A.A., Banda, M.A., Bachake, S.S. Jadhav, V.B, Deshpande, P.P., Adki, V.S., Gopika, M.K., Shinde, N.A., Sharma, J., Parashuram, S., Sangnure, V.R., Mundiwadikar, D.M., & Singh, N.V. 2019. Quality RNA isolation, cDNA synthesis and qPCR validation of differentially expressed gene in Punica granatum L. under influence of Xanthomonas axonopodis pv.punicae. Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 8(3), 2542-2547.
Wang, L., & Stegemann, J. 2009. Extraction of high quality RNA from polysaccharide matrices using cetlytrimethylamonium bromide. Biomaterials, 31(7), 1612-1618.
arei, A., Zamani, Z., Mousavi, A. Fatahi, R., Karimi Alavijeh, M., & Dehsara Salami, S.A. 2012. An Effective protocol for isolation of high- quality RNA from pomegranate seeds. The Asian and Australasian Journal of Plant Science and Biotechnology, 6, 32-37.
Zepeda, B., & Verdonk, J. 2022. RNA extraction from plant tissue with homemade acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform (AGPC). Current Protocols, 2, e351.
Zheng, Q.M., Tang, Zh., & Xu, Q. 2014. Isolation, phylogenetic relationship and expression profiling of sugar transporter genes in sweet orange (Citrus sinensis). Plant Cell Tissue Organ Culture, 119, 609-62.
تولیدات گیاهی
دوره 46، شماره 1
خرداد 1402
صفحه 1-10
فایل ها
هم رسانی
ارجاع به این مقاله
آمار